Dosage du pouvoir hémolytique d’une suspension de bactériophage purifiée.

M. Pichon-Pramil1, B. Lapras1, M. Medina2, M. Cristofoli1, C. Marchand1, C. Merienne1, F. Laurent2, F. Pirot1
1 Unité de Préparation et de Contrôle des Médicaments, plateforme FRIPHARM, Pharmacie à Usage Intérieur, Groupement Hospitalier Edouard Herriot – Hospices Civils de Lyon
2 Institut des Agents Infectieux, Laboratoire de Biologie et d’Anatomie Pathologique, Groupement Hospitalier Croix Rousse - Hospices Civils de Lyon

Objectif
L’utilisation de bactériophages (BP) à visée thérapeutique, ou phagothérapie, est en voie de développement [1]. Les BP anti-S. aureus sont produits sur la bactérie ciblée. Cette étape entraine un relargage de toxines bactériennes, dont l’hémolysine, qui doivent être purifiées. L’objectif du travail est de développer une méthode analytique contrôlant l’absence d’hémolysine après purification.

Méthode
Pour quantifier l’hémoglobine libérée par hémolyse de sang de mouton lavé au PBS (GR), celle-ci est transformée par une solution de Drabkin® (D) en cyanométhémoglobine qui absorbe (Abs) à 540 nm et qui est dosable par spectrophotométrie UV-Visible. L’ASTM écrit qu’une solution est hémolytique si son index hémolytique %H est supérieur à 5,0% [2]. %H est calculé comme tel : %H=100[(CS-CT-)/CT+], avec CS : concentration en Hg d’une suspension de GR exposée à la suspension de BP, CT+ : concentration en Hg d’une suspension de GR où l’hémolyse est totale (témoin positif T+) et CT- : concentration en Hg d’un témoin négatif T-. Avec :
T- : 200 µL de GR ont étés suspendus dans 5 mL de NaCl 9‰, incubés 3 h à 37°C puis centrifugés 5 min à 800 G. 200 µL de surnageant ont réagi avec 5 mL de D avant mesure de l’Abs.
T+ : 200 µL de GR ont étés suspendus dans 5 mL de NaCl 9‰. 200 µL de la suspension ont réagi avec 5 mL de D puis ont été centrifugés 5 min à 800 G. L’Abs du surnageant a été contrôlée.
Solution test ST : 200 µL de GR ont étés suspendus dans 5 mL de suspension de BP, puis incubés 3 h à 37°C et centrifugé 5 min à 800 G. 200 µL de surnageant ont réagis avec 5 mL de D avant mesure de l’Abs. Afin de s’assurer de la précision de la méthode, des gammes entre 0 et 10% d’hémolyse maitrisée ont été réalisée avec des dilutions de Brij® (B) 0,5‰ (tensio-actif du D) dans du NaCl 9‰.

Résultats
5 gammes d’hémolyse maitrisée ont été réalisées en lysant des GR dans des solutions de B 0.5‰ diluée dans du NaCl 9‰ à 0,0 ; 3,0 ; 5,0 ; 7,0 ; 10,0 et 100,0% v/v. Les moyennes et intervalles de confiance à 5,0% des %H sont respectivement, entre 3,0 et 10,0% v/v de B diluée, de 2,3% [0,6 ; 4,0], 6,0% [2,5 ; 9,5], 7,2% [2,1 ; 12,3], 12,2% [0,4 ; 24,1]. Le coefficient de corrélation linéaire R² de la moyenne des gammes entre 0,0 et 10,0% v/v de B étaient de 0,949. Il y a donc une corrélation linéaire entre la concentration de B et l’hémolyse provoquée.
Les solutions T-, T+ et ST seront réalisées dans un second temps.

Discussion
Malgré une faible précision (CV=85,6%), la méthode démontre une linéarité entre %H et la concentration en B. La validation de la méthode sera ensuite réalisée avec de l’hémolysine diluée et mise en contact 3h à 37°C avec les GR. Cela pourrait améliorer significativement la précision des gammes d’hémolyse maitrisée. Après validation, cette méthode sera utilisée pour réaliser le CQ des suspensions de BP anti-S. aureus après purification.

[1] : Ferry T, Kolenda C, Batailler C and al. Phage Therapy as Adjuvant to Conservative Surgery and Antibiotics to Salvage Patients With Relapsing S. aureus Prosthetic Knee Infection. Front Med. 2020 nov 16 ;7:570572.
[2] : ASTM. Standard Practice for Assessment of Hemolytic Properties of Materials. Book of Standards. 2017 ; 13.01 :6

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