Validation de méthode de dosage par chromatographie liquide à haute performance à détection UV de la lidocaïne, prilocaïne et tétracaïne

Introduction
Actuellement, excepté l’injection péri-lésionnelle de lidocaïne, il existe peu d’alternative de prise en charge analgésique, en urgence, d’effraction cutanée traumatique. Cette prise en charge est peu ergonomique pour l’équipe soignante et inconfortable pour le patient. Dans ce contexte, une nouvelle formulation topique d’anesthésiques locaux a été développée, à partir de lidocaïne (L), prilocaïne (P) et tétracaïne (T). Ainsi, l’objectif de ce travail était de développer et de valider une méthode de dosage par Chromatographie Liquide Haute Performance (CHLP), nécessaire pour démarrer une étude de stabilité et des évaluations biopharmaceutiques.

Matériels & méthode
La validation analytique a été conduite selon les recommandations du Conseil international d’harmonisation. La séparation par CHLP (SHIMADZU^®) a été effectuée avec : une colonne KINETEX^® (C-18, 2.6 µm, 150 mm x 4,6 mm) thermostatée à 25 °C ; une phase mobile composée d’acétonitrile et d’un tampon phosphate 40 mM à pH 7 (40/60, v/v) ; un débit fixé à 1 mL/min pour un volume d’injection à 20 µL. La détection a été réalisée par UV (λ = 220 nm et λ = 330 nm). L’intervalle de concentrations a été défini de 12 à 28 µg/mL, cible à 20 µg/mL. Pour valider la spécificité, trois solutions mères, ont été préparées et comparées à un blanc, une pour chaque principe actif. La linéarité, la fidélité, l’exactitude ont été déterminées. Des tests de dégradation forcée ont été conduits avec 1 mL de solutions à 80 µg/mL pour chacune des molécules, et mis en contact (100 °C) dans un flacon en verre scellé avec : 1 mL de HCl 1 N pendant 6 h, ou 1 mL de NaOH 1 N pendant 1 h, ou 1 mL de H2O2 10 % pendant 3 h. À la sortie du four, les solutions ont été neutralisées avec du HCl ou NaOH et/ou complétées avec la phase mobile.

Résultats
Les temps de rétention (Tr) sont restés stables : 7,1 min ± 5 % pour L, 3,7 min ± 5 % pour P et 5,7 min ± 5 % pour T. La méthode de dosage a démontré sa spécificité avec une bonne séparation des pics chromatographiques (R > 1,5) ; λ = 330 nm est spécifique de T ; sa linéarité entre 12 à 28 µg/mL (n = 15) avec un coefficient de corrélation r = 0,999 (p < 0,05) pour les 3 molécules ; sa fidélité avec un coefficient de variation < 1,52 % (n = 27) ; son exactitude avec des taux de recouvrement entre 99 et 101 %. En milieu acide et basique, L et P n’ont pas été dégradés. En conditions oxydatives, 78 % de L et 32 % de P ont été dégradés. Dans toutes les conditions, T a complétement été dégradée. Aucun produit de dégradation n’est détecté aux Tr des molécules dosées.

Discussion - Conclusion
La méthode est validée selon les critères de la directive internationale ICH Q2 (R1). Cette méthode permet la mise en place d’un dosage précis de L, P et T. L’étude de stabilité et les évaluations biopharmaceutiques peuvent, désormais, être conduites.