Validation d’une méthode microbiologique rapide pour le contrôle de stérilité des collyres à l’atropine

Contexte
Les collyres à base d’atropine sont des préparations ophtalmiques stériles largement utilisées en pédiatrie pour ralentir la progression de la myopie. Afin de répondre à une demande croissante, une production par lots a été mise en place. Pour le contrôle de stérilité, une méthode alternative décrite dans la Pharmacopée européenne (PE) (5.1.6) est appliquée. Cette méthode repose sur un système automatisé de détection de la croissance microbienne fondé sur la mesure du dioxyde de carbone (CO₂) produit au cours du métabolisme microbien, entraînant une variation du pH détectée par un capteur colorimétrique.
L’objectif de cette étude était d’évaluer les performances de cette méthode microbiologique rapide et de la comparer à la méthode de référence par inoculation directe (PE 2.6.1).

Matériels/Méthodes
Un lot de collyre à l’atropine à 0,01 % (N = 100) a été préparé dans des conditions aseptiques. Des essais d’applicabilité ont été réalisés conformément aux recommandations de la PE (5.1.6) en inoculant deux concentrations (5 et 20 UFC) des six micro-organismes suivants : S. aureus, P. aeruginosa, B. subtilis, C. sporogenes, C. albicans et A. brasiliensis. Pour les deux méthodes, conformément à la PE 2.6.1, la moitié du contenu (4,5 ml) de chaque récipient a été inoculée avec chaque micro-organisme. Pour la méthode alternative, des flacons spécifiques ont été ensemencés pour les micro-organismes aérobies et anaérobies. Pour la méthode de référence par ensemencement direct, des milieux liquides stériles (bouillon tryptone soja et milieu thioglycolate) ont été utilisés. Les analyses ont été réalisées en triplicat. Pour la méthode alternative, les flacons ont été incubés à 30 °C pendant 7 jours, avec des relevés automatisés toutes les 10 minutes. Pour la méthode directe, les milieux ont été incubés pendant 14 jours à 32,5 °C (± 2,5 °C) pour les bactéries et à 22,5 °C (± 2,5 °C) pour les champignons. Une inspection visuelle quotidienne a été réalisée afin de détecter toute turbidité.

Résultats/Discussion
Pour les deux niveaux d’inoculum, le délai moyen de détection des bactéries était d’environ 37 heures avec la méthode de référence contre 28 heures avec la méthode microbiologique rapide, soit une réduction significative du délai de détection. Cependant, A. brasiliensis n’a pas été détecté aux niveaux d’inoculum de 5 et 20 UFC avec la méthode rapide, alors qu’une croissance a été observée avec la méthode de référence. Avec la méthode rapide, la détection n’a été obtenue qu’à des niveaux d’inoculum plus élevés (50 et 100 UFC) et après augmentation de la température d’incubation à 35 °C. Pour les champignons, les délais de détection étaient d’environ 76 heures avec la méthode de référence et de 28 heures avec la méthode rapide. Les témoins négatifs sont restés stériles.

Conclusion
La méthode microbiologique rapide est validée pour le contrôle de stérilité des collyres à base d’atropine à 0,01 %. Elle permet une détection reproductible des micro-organismes et présente de meilleures performances que la méthode de référence décrite dans la PE (2.6.1). La méthode microbiologique rapide fournit des résultats plus rapides, toutefois, elle n’est applicable qu’aux produits sans activité antimicrobienne, pour lesquels le contrôle de stérilité par filtration sur membrane (incubation de 14 jours) constitue la méthode de référence. Un repiquage sur milieu solide en vue de l’identification du micro-organisme.