Optimisation et validation de l’essai des endotoxines bactériennes dans des mélanges binaires de nutrition parentérale

Afin d’assurer l’absence d’endotoxines bactériennes dans les Poches Binaires de Nutrition Parentérale (PB NP) fabriquées par notre unité, notre Pharmacie à Usage Intérieur (PUI) a souhaité intégrer à leurs contrôles libératoires l’Essai des Endotoxines Bactériennes (EEB) ou test LAL tel décrit dans la Pharmacopée Européenne (PE). Il s‘agit d’une technique dont les résultats peuvent être influencés par les conditions opératoires, environnementales, les interférences du milieu ainsi la composition qualitative et quantitatives des poches préparées. L’objectif de ce travail est la mise au point, l’optimisation et la validation du test LAL automatisé dans nos conditions locales de préparation.
La présence d’endotoxines et leurs teneurs ont été évaluée par mesure indirecte de la formation d’un gel réactif avec du lysat d’amoebocytes de Limulus (LAL). Cette mesure est réalisée par spectrophotomètre multicartouches Endosafe MCS (Charles River). La sensibilité des cartouches préchargées de réactifs utilisés était de 0,005 UI/mL.
L’étude a évalué les éléments suivants :
1-Détermination de la Concentration Limite en Endotoxines (CLE) des PB-NP. Ce paramètre, dépendant du poids et du débit d’administration, a été défini en calculant rétrospectivement les CLE retrouvées pour des PB-NP produites pour 30 patients (n=157 poches) et en sélectionnant comme limite basse la plus faible valeur retrouvée.
2-Détermination qualitative et quantitative des composants ioniques des PB-NP à risque d’interférences avec le réactif LAL, en utilisant des données de la littérature et du référentiel de prescription de nutrition parentérale de l’établissement, permettant la définition d’une Poche Worst Case (PWC) qui contenaient la plus forte teneur d’ions interférants.
3-Définition du facteur de dilution (FD) considérant la sensibilité de l’essai et sa pertinence technique et une facilité de réalisation en routine.
4- Enfin, validation de l’EEB sur la PWC avec ce FD, évaluant répétabilité (n=9), fidélité intermédiaire (n=9) et reproductibilité de l’essai (n=9), selon les critères d’acceptation fixés par la PE.

Ce travail a permis de fixer, en lien avec un débit d’administration de 9,3 mL/h retrouvé chez un nouveau-né de 1,43 kg, la CLE fixée à 0,7UI/mL. Les facteurs d’interférences identifiés étaient le calcium, le magnésium et le zinc ; leurs concentrations maximales prescriptibles, présentes dans la PWE, étaient respectivement de 1,54 mg/mL, 15,38 µmol/mL et 5,77µmol/mL. Le FD calculé était 41 (25µL dans 1mL) permet de conserver une sensibilité < 0,205UI/mL et d’utiliser des pipettes de 25 µL et 1000 µL à volumes fixes, plus précises. La répétabilité, la fidélité intermédiaire et la reproductibilité étaient conformes aux spécifications de la PE.
L’EEB dans les PB-NP a été ainsi validé avec la définition des conditions opératoires optimales permettant de contourner les interférences chimiques en respectant une sensibilité minimale théorique de l’équipement.
Après cette phase de validation, suivra la phase de formation et de qualification des préparateurs en pharmacie pour l’utilisation de cette technique nécessitant une maîtrise et une dextérité particulières.
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