Mise en place de l’essai des endotoxines dans une émulsion vitamino-lipidique

Introduction

La pharmacie hospitalière cherche à centraliser la production de seringues vitamino-lipidique. Un test de stérilité et une stabilité physique dans le temps ont été réalisés au préalable sur ce mélange.

La recherche des endotoxines bactériennes est préconisée par la pharmacopée européenne, pour les solutions stériles administrées par voie parentérale.

Le test LAL (lysat d’amoebocytes de limule) est utilisé pour quantifier la quantité d’endotoxine provenant des bactéries GRAM – en utilisant la capacité de réaction des aemobocytes des limules avec les endotoxines.

L’objectif de cette étude est de valider la méthode dans une solution lipidique de nutrition parentérale.

Matériels et méthodes

Une machine Endosafe®-MCS, Charles River® a été utilisé avec des cartouches Charles River®‘s pré-remplies en pro-enzyme et substrat synthétique (sensibilité 0.005 UI/mL). Chaque cartouche contient 4 puits dont 2 surchargés en endotoxines (témoins positifs).

La méthode utilisée est la méthode de colorimétrie cinétique décrite dans la pharmacopée européenne.

• La concentration limite en endotoxines et la dilution maximale significative (DMS) ont été calculés. La concentration limite en endotoxines dépend du poids et du débit de perfusion.
  25 prescriptions de réa-néonatalogie ont été donc analysées. La DMS dépend de la sensibilité de la cartouche, de la limite en endotoxines et de la concentration de l’échantillon.
• Le test est considéré sans interférence si, la concentration limite en endotoxines mesurée dans l’échantillon est entre [50-200%] de la concentration connue des puits témoins positifs. Une dilution avec du NaCl 0.9% ou de l’eau EEB (eau pour essai des endotoxines bactériennes) est réalisée sans dépasser la DMS, pour enlever les éventuels interférences.
• Une dernière expérience a été réalisée consiste à contaminer des seringues en endotoxines à une concentration de 5UI/mL. La concentration mesurée une fois contaminée est comparée à la concentration théorique attendue. (Test non-pharmacopée).

Résultats et discussion

Après analyse des prescriptions, un cas extrême a été détecté : poids 1.1 kg et débit de perfusion 1.1 ml/h. La concentration limite en endotoxines a donc été fixée à 5 UI/mL.

En utilisant de l’eau EEB, le taux de recouvrement n’est pas dans l’intervalle de validation. En utilisant du NaCl 0,9% apyrogène, la méthode a pu être validée 3 fois. La DMS a été fixée à 500 avec du NaCl 0.9%.

Le rôle et le mécanisme d’action du NaCl restent obscurs. L’hypothèse principale étant que le NaCl augmente la sensibilité des endotoxines en augmentant les forces de liaisons ioniques.

Pour finir, la surcharge en endotoxines 5UI/mL a été détectée seulement 2 fois sur 3. Un contrôle positif et un contrôle négatif ont été réalisés. La concentration d’endotoxines retrouvée dans l’échantillon est de 3UI/mL et de 4UI/mL. La concentration à 5 UI/mL n’a pas été retrouvée malgré la validation des tests référencés à la pharmacopée.

Conclusion

Ce test est conforme à la pharmacopée. La DMS a été fixée à 500. Le test peut être exécuté en routine.