Mise au point et validation de l’essai de stérilité par filtration sur membrane de collyres de vancomycine 5%

Introduction
Dans notre unité de pharmacotechnie, le contrôle de la stérilité des collyres de vancomycine 5% est réalisé par ensemencement direct sur géloses Trypticase-Soja et Sabouraud. Or la Pharmacopée Européenne (PE) recommande la méthode de filtration sur membrane dès que la nature du produit le permet.

Objectif
Mettre au point et valider la méthode d’essai de stérilité par filtration sur membrane de collyres de vancomycine 5%.

Matériel & Méthode
Les essais sont réalisés selon la PE 10^ème Ed. « 2.6.1. Stérilité » à l’aide d’une pompe péristaltique Steritest^® Symbio LFH (Merck-Millipore) avec un essai de fertilité (témoin positif) et un essai de stérilité comprenant chacun 3 étapes : prémouillage de la membrane, filtration du collyre (8 mL), rinçage de la membrane. Les membranes sont ensuite mises en incubation dans des milieux de culture. Les canisters utilisés ont une membrane PVDF (porosité < 0.45µm). Les aliquotes de 6 souches microbiennes sont préparés à partir de billes BioBall^® Multi-shot 550 (Biomérieux) et introduits à l’étape de rinçage. La pousse microbienne dans les canisters doit témoigner de l’efficacité du rinçage. Dans un premier temps, le protocole utilisé est une transposition de celui validé pour les collyres de Ceftazidime 5% dans notre unité. Après échanges avec différents centres, d’autres essais sont réalisés en modifiant les paramètres suivants : dilution du collyre, vitesse de pompe, composition du fluide de rinçage.

Résultats
La transposition seule du protocole validé pour les collyres de Ceftazidime 5% ne permet pas une validation de la méthode avec une pousse non reproductible de Staphylococcus aureus. L’ajout d’une étape de dilution du collyre permet une pousse reproductible de S. aureus mais pas de pousse de Bacillus subtilis et Clostridium sporogenes. Les essais réalisés après modification des vitesses de pompe ne montrent pas de pousse de B. subtilis et C. sporogenes. L’essai d’un fluide de rinçage différent ne permet pas la pousse de B. subtilis et une pousse non reproductible de C. sporogenes. Les pousses sont reproductibles pour les 4 autres souches microbiennes testées.

Discussion & Conclusion
L’essai d’applicabilité réalisé selon la PE permet de valider la méthode pour 4 des 6 souches microbiennes testées. Au vu de nos résultats, comparables à ceux d’autres centres, B. subtilis semble être la souche critique pour les essais de stérilité des collyres de Vancomycine 5%. L’étape de dilution est une étape intéressante mais l’utilisation du NaCl doit être privilégiée à l’eau PPI pour ne pas lyser les souches microbiennes. L’utilisation d’un fluide de rinçage intégrant un neutralisant ne permet pas une inhibition complète de la Vancomycine. Une adsorption de la vancomycine sur la membrane serait l’hypothèse principale de l’absence de pousse pour B. subtilis et C. sporogenes.

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