Étude, par HPLC-UV et Électrophorèse, de dégradation forcée d’une nouvelle protéine élastique synthétique thérapeutique conditionnée en sérum salé isotonique

Introduction et objectif
Le Laboratoire de Biologie Tissulaire et Ingénierie Thérapeutique a développé une protéine synthétique élastique (SEP). Cette protéine recombinante a pour but de restaurer l’élasticité des tissus altérés par des élastinopathies génétiques du fait de son action de prothèse moléculaire. La SEP est un agent biothérapeutique non structuré dont l’action n’est pas liée à sa conformation et dont la stabilité n’est pas encore connue. Il existe à ce jour une seule méthode de dosage de la SEP validée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée à un détecteur UV.
L’objectif de cette étude est d’effectuer la première étude de dégradation forcée de la SEP afin d’identifier les conditions à l’origine de sa dégradation et de vérifier le caractère indicateur de stabilité la méthode de dosage de la SEP.

Matériels et Méthodes
Quinze conditions de dégradation ont été testées pendant 7 durées d’exposition qui s’étendent de 0,5 à 168 h : des cycles de congélation-décongélation, l’exposition à des températures de 37°C ou 80°C ; des ultra-violets (UV) à 254 nm et 365 nm ; des solutions acides (HCl) de pH 1, 2 4 et 6 à 80°C ; des solutions basiques (NaOH) de pH 8, 10 et 13 à 80°C ; des solutions de pH 1 et 13 à 20°C ; des solutions de peroxyde d’hydrogène 3% 80°C. Chaque condition a été testée sur 2 échantillons de SEP et est contrôlée par une solution de NaCl 0,9%. Après neutralisation du facteur de dégradation testé, le spectre d’absorption UV des échantillons a été déterminé par spectrophotométrie UV-visible avant analyse par HPLC-UV. Puis les échantillons semblant présenter à l’HPLC une dégradation de 5 à 20%, ont été analysés par SDS-PAGE (électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du dodécysulfate de sodium) coloré en bleu de Coomassie et par Western-Blot anti-Flag.

Résultats
La spectrophotométrie a permis de déterminer 2 longueurs d’ondes d’analyse à 210 et 265 nm utilisées en HPLC-UV. À l’exception de l’exposition aux UV (254 ou 365 nm), toutes les conditions ont permis d’atteindre 5 à 20 % de dégradation de la SEP en un temps inférieur ou égal à 168 h. Les chromatogrammes ne montrent qu’un seul pic qui diminue en aire sous la courbe ou s’élargit en fonction des conditions de dégradation. Les migrations sur gels ont permis de mettre en évidence la présence de produits de dégradation non observés par HPLC. Ainsi la méthode de dosage de la SEP ne permet pas de distinguer clairement la protéine de ses produits de dégradation et n’est donc pas une méthode indicatrice de stabilité.

Discussions et conclusions
Cette étude a permis de discriminer les situations provoquant une dégradation de la SEP. Il est nécessaire de faire évoluer notre méthode de dosage pour en augmenter la résolution avant de pouvoir identifier des produits de dégradation par spectrométrie de masse.

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