Développement et validation d’une méthode de dosage du fluconazole pour l’étude de la stabilité d’un médicament expérimental

Contexte
La Pharmacie à Usage Intérieur (PUI) de notre groupement hospitalier est sollicitée pour un essai clinique nécessitant des gélules de fluconazole 50 mg et leurs placebos.

Objectif
L’objectif principal de cette étude est de développer et de valider une méthode de dosage du fluconazole indicatrice de stabilité par chromatographie liquide haute performance et détection ultra-violette (HPLC-UV) pour l’étude de stabilité et le contrôle de ces gélules.

Matériels et méthodes
La gamme de calibration est comprise entre 100 et 500 µg/mL, les standards de validation cibles sont de 150, 300 et 450 µg/mL. L’HPLC-UV comprend une phase stationnaire octadécylsilylée thermostatée à 40°C (150 x 4,6 mm, 5 µm) et une phase mobile méthanol / tampon acétate à pH 5,0 (40:60, v/v). La longueur d’onde utilisée est 261 nm. Le profil d’exactitude, utilisé comme protocole de validation selon les recommandations de la SFSTP, permet d’estimer la linéarité, la fidélité, la justesse, les limitations de quantification ainsi que l’inexactitude de mesure en fonction des concentrations. Des tests de dégradation forcée (DF) [3] sont réalisés sur le contenu des gélules : soumission à un traitement alcalin (1 M NaOH, 80°C, 4 h), acide (1 M HCl, 80°C, 4 h), oxydant (H2O2 à 3%, 3:1, 80°C, 4 h), thermique (80°C, 4 h) et photo-oxydant (UV 265 nm, 3 h), afin d’identifier d’éventuels produits de dégradation.

Résultats
Aucune interférence entre principe actif, excipients et produits de dégradation n’est observée (résolution chromatographique ≥ 1,5). Le temps de rétention du fluconazole est 3,1 min. Les paramètres de validation sont conformes aux spécifications dans le domaine de validité des gammes : linéarité (R² > 0,99), fidélités intra et inter jour (CV < 5% et CV < 8% par ANOVA) et justesse (CV < 10%). Les limites de l’intervalle de tolérance sont toutes inclues dans l’intervalle d’acceptabilité défini (10%). Les tests de DF en condition alcaline font apparaitre des composés à 1,27 min, 1,44 min, 1,61 min et 1,89 min, tous dus à la dégradation d’un des excipients de la spécialité pharmaceutique. Aucun produit de dégradation n’apparaît lors des autres tests DF.

Discussion / Conclusion
La méthode de dosage indicatrice de stabilité des gélules de fluconazole par HPLC-UV est validée et permet à la PUI de réaliser l’étude de stabilité des gélules dans le cadre de cet essai clinique.

Référence
[3] Coord. V. Sautou. 1ère éd. SFPC/GERPAC, 2013. Guide méthodologique des études de stabilité des préparations.

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