Développement d’une méthode de quantification des endotoxines bactériennes dans des préparations injectables d’émulsions vitamino-lipidiques par le facteur C recombinant

Introduction
Les émulsions vitamino-lipidiques (ELIV) sont des préparations de nutrition parentérale, destinées aux patients de néonatalogie. Ces préparations injectables doivent satisfaire les exigences de la Pharmacopée Européenne (PE) concernant l’essai des endotoxines bactériennes (ETB). L’essai décrit dans la monographie 2.6.14 est basé sur la réaction du lysat d’amoebocytes de limule (LAL). Cependant, il soulève des préoccupations écologiques, éthiques et économiques, tout en étant sujet à l’apparition de faux positifs, alors que l’essai de la monographie 2.6.32 de la PE, basé sur le clivage d’un peptide fluorogène par le facteur C recombinant (rFC) permet de s’affranchir de ces problématiques. Néanmoins, la présence de lipides, outre l’opacification de la préparation, peut nuire à la quantification des ETB par formation d’un complexe lipido-polysaccharidique. L’objectif a été de développer une préparation d’échantillon permettant le dosage des ETB dans une matrice lipidique par la méthode du rFC.

Matériel et méthodes
La fluorescence a été mesurée par un lecteur de plaques (Agilent - BioTek Synergy HTX - Endonext^® - Biomérieux) avec le kit Endozyme II Go. Chaque échantillon a été analysé avec 2 puits échantillons et 2 puits contrôles à 0,5 UE (unité d’endotoxine) /ml associé à une gamme standard (0,005 à 5 UE/ml). Selon la PE, le spike recovery (SR), calculé à partir de la différence de concentration en ETB entre un échantillon dopé et non dopé, doit être compris entre 50 et 200 % et les coefficients de variation < 25%. La sensibilité a été fixée à 0,005 UE/ml en lien avec la concentration limite en ETB (3,3 UE/ml) et la dilution maximale significative calculée à partir de l’analyse de 600 prescriptions d’ELIV. Les échantillons ont été préparés avec ou sans chauffage et sonication, en variant le facteur de dilution (pur, 20, 40, 100 et 200e) et le diluant (NaCl et EPPI additionnée ou non de polysorbate 20 (PS) à 0,025% ; 0,05% ou 0,1%). Après sélection des paramètres optimaux, les ELIV ont été dopées à 0,01 ; 0,02 ; 0,03 et 0,05 UE/ml pour valider l’absence d’interférence (n=5).

Résultats et discussion
La sonication, le chauffage, les dilutions au 20e et 40e n’ont pas permis la levée de l’interférence, contrairement aux dilutions au 100e et 200e avec des concentrations en PS à 0,05 et 0,025%. La dilution au 100e et 200e avec l’EPPI-PS à 0,025% permettent respectivement d’obtenir un SR moyen ± intervalle de confiance à 95% (IC95) de 97% ± 4 et 103% ± 6 avec un pourcentage d’erreur moyen ± IC95 de 31% ± 6. Ces dilutions, malgré la sous-estimation inhérente à la sensibilité de la méthode, permet une quantification adaptée à la concentration limite calculée en ETB.

Conclusion
Ce travail valide l’essai des ETB par la méthode du rFC dans les ELIV. Cette approche ouvre la voie à une surveillance microbiologique plus écoresponsable et éthique que la méthode au LAL, applicable à d’autres préparations injectables.