Essai de stérilité par filtration sur membrane : essai d’applicabilité pour les collyres à l’amikacine 50 mg/mL

F. Saïag1, V. Lebreton1,2, A. Bourges1, M. Petit1, S. Vrignaud1
1 Pharmacie, Centre Hospitalier Universitaire d’Angers, France
2 Laboratoire MINT, INSERM U1066-CNRS 6021, Angers, France

Introduction
Les collyres à l’amikacine sont indiqués dans le traitement des kératites bactériennes graves. Ces préparations hospitalières répondent aux bonnes pratiques de préparation. Des contrôles physico-chimique (dosage) et microbiologique (essai de stérilité) doivent donc être effectués.
L’objectif de ce travail est de mettre au point l’essai d’applicabilité pour valider l’essai de stérilité des collyres à l’amikacine.

Matériel et méthode
La méthode de filtration sur membrane a été réalisée selon la Pharmacopée Européenne (PE) 10ème édition, monographie 2.6.1, à l’aide de la pompe Steritest™ Symbio LFH (Merck-Millipore) et des canisters d’une membrane en ester de cellulose 0,45 µm (Merck-Millipore). Les souches préconisées par la PE ont été étudiées : Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis et Candida albicans. Afin d’obtenir des inoculums inférieurs à 100 UFC, les BioBall® SingleShot calibrées à 30 UFC (bioMérieux) ont été utilisées. Pour s’affranchir de l’effet inhibiteur de l’amikacine le Diluant Neutralisant Pharmacopée (DNP) (Oxoid) a été ajouté aux collyres dosés à 50 mg/mL. Les milieux de culture utilisés sont le thioglycolate (TG) et l’hydrolysat de caséine de soja (HCS) (Oxoid). Tous ces produits sont conformes à la PE.
Brièvement, l’essai a été effectué comme suit, un pré mouillage de la membrane au DNP, filtration de 10 mL de collyre dilué dans 80 mL de DNP puis rinçage avec 90 mL de DNP. Par la suite, le rinçage de la membrane a été effectué en filtrant 300 mL de NaCl 0.9% en commençant par 50 mL de NaCl 0.9% contenant l’inoculum. Après cette étape les canisters ont été remplis avec les milieux de culture. Un témoin négatif a été réalisé à chaque session. Les essais ont été réalisés en triplicat.
A noter que les souches C. sporogenes, P. aeruginosa et S. aureus ont été incubées 5 jours dans le TG, (30- 35°C) alors que, les souches A. brasiliensis, B. subtilis et C. albicans ont été incubées 5 jours dans le HCS (20-25°C).

Résultats et discussion
A J3, la croissance des pathogènes C. sporogenes, P. aeruginosa, S. aureus, A. brasiliensis, B. subtilis et C. albicans était visuellement détectable. Après envoi pour identification au laboratoire de bactériologie, les résultats des analyses ont montré une pousse monomorphe de chaque pathogène. Les témoins négatifs n’ont jamais visuellement présenté de contamination microbiologique.

Conclusion
La validation de l’essai d’applicabilité pour les collyres amikacine 50 mg/mL a été réalisée avec succès. Ceci permet de valider l’essai de stérilité pour cette préparation car elle permet de bien conclure à l’absence de croissance de microorganisme. Cet essai pourra donc être utilisé en routine pour le contrôle microbiologique de ces préparations.

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